Анотація до роботи:

Євстигнєєв М.П. Міжмолекулярні взаємодії біологічно активних ароматичних речовин і ДНК у водному розчині. – Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня доктора фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Харківський національний університет ім.В.Н.Каразіна, м. Харків, 2006.

Методом ¹H ЯМР спектроскопії проведене систематичне дослідження нековалентних взаємодій різноманітних груп ароматичних біологічно активних сполук (БАС) (Кофеїн-БАС, Вітамін-БАС, Антибіотик-Антибіотик, Біс-інтеркалятор-БАС), виявляючих синергізм біологічної дії при спільному використуванні: самоасоціація, гетероасоціація, комплексоутворення з ДНК. Отримані структурні та термодинамічни параметри асоціації молекул та їх комплексоутворення з ДНК. Виявлено внесок різноманітних фізичних взаємодій в стабілізацію комплексів. Запропоновано новий підхід для аналізу багатокомпонентних розчинів ароматичних БАС з урахуванням всіх можливих міжмолекулярних взаємодій компонентів суміші. Запропонована фізична модель спільного зв'язування різноманітних ароматичних БАС з ядерною ДНК, на підставі якої проведено аналіз спільного зв'язування різноманітних комбінацій ароматичних БАС у групах Кофеїн-БАС-ДНК, Вітамін-БАС-ДНК і Антибіотик-Антибіотик-ДНК. Для досліджуваних груп продемонстрована потенційна можливість регулювання біологічної активності в комбінації ароматичних сполук і можливість кількісної оцінки очікуваного біологічного ефекту.

У дисертаційній роботі уперше дано вирішення важливої проблеми молекулярної біофізики - з'ясування фундаментальних механізмів регуляції медико-біологічної активності при спільному використанні різних комбінацій ароматичних біологічно активних сполук (БАС) і представлена завершена методика структурного і термодинамічного дослідження міжмолекулярних взаємодій різних груп БАС у багатокомпонентному розчині в присутності ДНК. Результати і висновки роботи поглиблюють представлення про взаємодії ароматичних БАС і формують основу для розуміння молекулярних механізмів синергетичних біологічних ефектів при спільному використанні ароматичних БАС. Отримані результати можуть бути використані в області біотехнології, молекулярної біології та фармакології.

Основні результати роботи можуть бути сформульовані наступним чином:

1. Вперше проведене систематичне дослідження методами 1М- і 2М-¹H ЯМР спектроскопії (500 МГц) нековалентних взаємодій різних груп ароматичних БАС (Кофеїн-БАС, Вітамін-БАС, Антибіотик-Антибіотик, Біс-інтеркалятор-БАС), які виявляють синергизм біологічної дії при спільному використанні. Отримано структурні (індуковані хімічні зсуви в складі комплексів, просторові структури димерів і 1:1 гетерокомплексів) і термодинамічні (рівноважні константи, ентальпія, ентропія, вільна енергія Гиббса) параметри асоціації молекул і їх комплексоутворення з фрагментом ДНК.

2. Установлено, що асоціація ароматичних БАС у водно-сольовому розчині носить характер стекингу хромофорів, переважно стабілізованого дисперсійними і гідрофобними взаємодіями. Параметри асоціації молекул не залежать від виду буферного розчинника, однак корелюють з типом бічних груп хромофора і кількістю ароматичних кілець взаємодіючих ароматичних сполук.

3. Уперше установлений факт додаткової стабілізації гетерокомплексів молекул у групах Вітамін-БАС і Антибіотик-Антибіотик міжмолекулярними водневими зв'язками. Сформульовано загальні закономірності водневого зв'язування при дослідженні асоціації ароматичних БАС методом ЯМР.

4. Аналіз асоціації ароматичних біс-інтеркаляторів дозволив уперше зробити висновок про існування значно більш складної динамічної рівноваги таких молекул у розчині, чим передбачалося раніше. Показано, що біс-інтеркалятори утворюють у розчині різні за структурою агрегати, які включають відкриту і закриту форми, частково інтеркальовані димери і тримери, а також є ефективними перехоплювачами молекул простих моноінтеркаляторів.

5. Запропоновано новий підхід до аналізу багатокомпонентних взаємодій ароматичних молекул у розчині, заснований на алгоритмічному моделюванні процесів асоціації молекул. Розроблена стохастична модель двох- і багатокомпонентної гетероасоціації.

6. Уперше вивчені трикомпонентні змішані розчини ароматичних БАС з обліком усіх можливих міжмолекулярних взаємодій компонентів суміші. Передбачено ефект дисоціації комплексу антрациклінових антибіотиків у присутності кофеїну, ефект зниження розчинності БАС при підвищених концентраціях гідротропного агента й ефект підвищення розчинності БАС у суміші гідротропних агентів.

7. Запропоновано фізичну модель спільного зв'язування різних ароматичних БАС з ядерною ДНК, в основі якої лежить уявлення про переважне зв'язування лігандів з вільними від білків ділянками ядерної ДНК.

8. Проведено аналіз спільного зв'язування різних комбінацій ароматичних БАС у групах Кофеїн-БАС-ДНК, Вітамін-БАС-ДНК і Антибіотик-Антибіотик-ДНК. Уперше введене поняття інтерцепторного і протекторного механізмів дії в системах Вітамін-БАС-ДНК і Антибіотик-Антибіотик-ДНК.

9. Знайдено емпіричні співвідношення, які дозволяють оцінити частку ліганду, витиснутого з ДНК при додаванні ліганда-перехоплювача, як функцію рівноважних констант гетероасоціації і комплексоутворення ліганду з ДНК, і критерій, що дозволяє вказати домінуючий процес, відповідальний за це.

10. Для трьох досліджених груп ароматичних БАС: Кофеїн-БАС, Вітамін-БАС, Антибіотик-Антибіотик продемонстрована потенційна можливість регулювання біологічної активності в комбінації ароматичних сполук і можливість кількісної оцінки очікуваного біологічного ефекту за умови домінування в системі протекторного і інтерцепторного механізмів.

Публікації автора:

1. Веселков А.Н., Высоцкий С.А., Евстигнеев М.П., Веселков Д.А., Дымант Л.Н., Болотин П.А., Дэвис Д.Б. Анализ взаимодействия антибиотика митоксантрона с ДНК в присутствии кофеина в водном растворе по данным ¹H ЯМР спектроскопии // Биополимеры и клетка. - 2002. - Т.18, №4. - С.287-296.

2. Веселков А.Н., Евстигнеев М.П., Высоцкий С.А., Веселков Д.А., Дэвис Д.Б. Термодинамический анализ взаимодействия антибиотика митоксантрона с дезокситетрануклеотидом 5’-d(TpGpCpA) в водном растворе по данным ¹H-ЯМР спектроскопии // Биофизика. - 2002. - Т.47, №3. - С.459-466.

3. 
   Веселков А.Н., Евстигнеев М.П., Эрнандес Сантьяго А., Рогова О.В., Веселков Д.А., Дэвис Д.Б. Исследование равновесных ассоциированных форм гомодимера этидия в водном растворе методом ¹H ЯМР спектроскопии // Физ.химия. - 2003. - Т.77, №11. - С.2060-2067.

   Евстигнеев М.П., Веселков А.Н. Вероятностная модель для исследования гетероассоциации ароматических красителей и кофеина методом ЯМР спектроскопии // Доповiдi НАН України (біофізика). - 2003. - №8. - С.715-719.

   Веселков А.Н., Евстигнеев М.П., Рогова О.В., Чубаров А.С., Дэвис Д.Б. Стохастическая модель для ЯМР анализа гетероассоциации биологически активных ароматических молекул // Биофизика. - 2004. - Т.49, Вып.4. - С.587-594.

   Евстигнеев М.П., Чубаров А.С., Эрнандес Сантьяго А.А. Учет кооперативности при анализе конкурентного связывания ароматических лигандов с дезокситетрануклеотидами // Вестник СевГТУ (Физика и математика). - 2004. - Т.59. - С.48-53.

   Evstigneev M.P., Hernandez Santiago A., Rogova O.V., Veselkov A.N. Comparative analysis of the self-association of ethidium mono- and bis-intercalators in aqueous solution using ¹H NMR spectroscopy // Proc. of SPIE. - 2004. - Vol.5507. - P.173-177.

   Veselkov A.N., Evstigneev M.P., Veselkov D.A., Hernandez Santiago A.A., Davies D.B. ¹H NMR investigation of the self-association of ethidium homodimer and its complexation with propidium iodide in aqueous solution // J.Mol.Struct. - 2004. – Vol.690. - P.17-24.

   Veselkov A.N., Evstigneev M.P., Rozvadovska A.O., Hernandez Santiago A.A., Zubchenok O.V., Djimant L.N., Davies D.B. ¹H NMR structural and thermodynamical analysis of the hetero-association of daunomycin and novatrone in aqueous solution // J.Mol.Struct. - 2004. – Vol.701. - P.31-37.

   Розвадовская А.О., Евстигнеев М.П., Мухина Ю.В., Кисуркин Д.В., Веселков А.Н. Анализ гетероассоциации гидротропных агентов кофеина и никотинамида в водном растворе методом ¹H ЯМР спектроскопии // Вестник СевГТУ (Физика и математика). - 2004. - Т.59. - С.30-38.

   Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Кисуркин Д.В., Эрнандес Сантьяго А.А., Дэвис Д.Б., Веселков А.Н. Анализ гетероассоциации антиопухолевых антибиотиков новатрона и актиномицина D в водном растворе методом ¹H ЯМР спектроскопии // Доповiдi НАН України (біофізика). - 2004. - №12. - С.168-174.

   Эрнандес Сантьяго А.А., Хомич В.В., Евстигнеев М.П. Анализ смеси трех ароматических компонент: диссоциация комплекса антрациклиновых антибиотиков в присутствии кофеина // Вестник СевГТУ (Физика и математика). - 2005. - Т.70. - С.23-30.

   Мухина Ю.В., Евстигнеев М.П. Связывание ароматических лигандов с ДНК в присутствии витамина // Вестник СевГТУ (Физика и математика). - 2005. - Т.70. - С.62-73.

   Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Чубаров А.С., Эрнандес Сантьяго А.А., Дэвис Д.Б., Веселков А.Н. Структурный и термодинамический анализ гетероассоциации молекул дауномицина и флавин-мононуклеотида в водном растворе методом ¹H ЯМР спектроскопии // Журн.структур.химии. - 2005. - Т.46, №1. - С.70-76.

   Евстигнеев М.П., Хомич В.В., Дэвис Д.Б. ¹H ЯМР анализ само- и гетероассоциации антибиотика доксорубицина и кофеина в водном растворе // Физика живого. - 2005. - Т.13, №2. - С.71-82.

   Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Эрнандес Сантьяго А.А., Мухина Ю.В., Веселков К.А., Рогова О.В., Дэвис Д.Б. Веселков А.Н. Анализ ассоциации кофеина с флавинмононуклеотидом по данным ПМР-спектров в водном растворе // Физ.химия. - 2005. - Т.79, №4. - С.673-679.

   Веселков А.Н., Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Мухина Ю.В., Дэвис Д.Б. Структурный и термодинамический анализ гетероассоциации молекул новатрона и флавинмононуклеотида в водном растворе методом ¹H ЯМР спектроскопии // Биоорг.химия. - 2005.-Т.31,№5.-С.503-510.

   Веселков А.Н., Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Мухина Ю.В., Рыбакова К.А., Дэвис Д.Б. Анализ комплексообразования ароматических молекул антибиотика и витамина в водном растворе методом ¹H ЯМР спектроскопии: гетероассоциация актиномицина D и флавин-мононуклеотида // Биофизика. - 2005. - Т.50, Вып.1. - С.20-27.

   Davies D.B., Evstigneev M.P., Veselkov D.A., Veselkov A.N. Hetero-association of anti-cancer antibiotics in aqueous solution: NMR and molecular mechanics analysis // Biophys.Chem. - 2005. - Vol.117. - P.111-118.

   Evstigneev M.P., Mykhina Yu.V., Davies D.B. Complexation of daunomycin with a DNA oligomer in the presence of an aromatic vitamin (B₂) determined by NMR spectroscopy // Biophys.Chem. - 2005. - Vol.118. - P.118-127.

   Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Дэвис Д.Б. ¹H ЯМР исследование гетероассоциации ногаламицина с ароматическими антиопухолевыми антибиотиками // Вісн.Харк.нац.ун-та №665, Біофіз.вісн. - 2005. - Вип.1(15). - С.43-48.

   Evstigneev M.P., Davies D.B., Veselkov A.N. Stochastic models (cooperative and non-cooperative) for NMR analysis of the hetero-association of aromatic molecules in aqueous solution // Chem. Phys. - 2006. - V.321. - P.25-33.

   Розвадовская А.О., Евстигнеев В.П., Дэвис Д.Б., Евстигнеев М.П. Взаимодействие ароматических антибиотиков и витаминов: ¹H ЯМР анализ гетероассоциации никотинамида с антрациклиновыми антиопухолевыми антибиотиками // Биофизика. - 2006. - Т.51, №2. - С.214-224.

   24. 
       Евстигнеев М.П., Хомич В.В., Дэвис Д.Б. Исследование самоассоциации антибиотика дауномицина в различных буферных растворителях // Физ.химия. - 2006. - Т.80, №5. - С.854-859.

   25. Evstigneev M.P., Rybakova K.A., Davies D.B. Complexation of norfloxacin with DNA in the presence of caffeine // Biophys.Chem. - 2006. - Vol.121. - P.84-95.

   26. Evstigneev M.P., Evstigneev V.P., Davies D.B. ¹H NMR determination of the self-association of an acridine homodimer and its complexation with ethidium bromide in aqueous solution // J.Mol.Str. - 2006. - Vol.784. - P.162-168.

   27. Evstigneev M.P., Mukhina Yu.V., Davies D.B. ¹H NMR study of the hetero-association of flavin-mononucleotide with mutagenic dyes: ethidium bromide and proflavine // Molecular Phys. - 2006. - V.104, N4. - P.647-654.

   28. Evstigneev M.P., Evstigneev V.P., Hernandez Santiago A.A., Davies D.B. Effect of a mixture of caffeine and nicotinamide on the solubility of vitamin (B₂) in aqueous solution // Eur. J. Pharm. Sci. - 2006. - Vol.28. - P.59-66.

   29. Евстигнеев М.П., Барановский С.Ф., Рыбакова К.А., Дэвис Д.Б. Исследование комплексообразования хинолонового антибиотика норфлоксацина с ДНК методом ¹H ЯМР спектроскопии // Молекулярная биология. – 2006. – Т.40, №5. - С.894-899.

   30. Евстигнеев М.П., Евстигнеев В.П., Шокуров М.В. Стохастическая модель для ЯМР анализа многокомпонентных растворов биологически активных ароматических молекул // Вісн.Харк.нац.ун-та №716, Біофіз.вісн. - 2005. – Вип.2(16). – С.10-14.

   31. Евстигнеев М.П., Рыбакова К.А., Дэвис Д.Б. Гетероассоциация антибиотика норфлоксацина с ароматическими витаминами в водном растворе // Биофизика. - 2006. – Т.51, №4. – С.734-743.

   32. Евстигнеев М.П. Совместное связывание биологически активных ароматических молекул и кофеина с ДНК в водном растворе // Физика живого. - 2006. – Т.14, №1. – С.29-40.

   33. Bolotin P.A., Baranovsky S.F., Evstigneev M.P. Spectrophotometric investigation of the hetero-association of caffeine and thiazine dye in aqueous solution // Spectrochimica Acta: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. - 2006. - V.64A. - P.693-697.

   34. Evstigneev M.P., Rogova O.V., Hernandez Santiago A., Chubarov A.S., Veselkov A.N. Parameters of self- and hetero-association of aromatic ligands using NMR spectroscopy and different theoretical approaches // Book of Abstracts of XVI International School-Seminar Spectroscopy of Molecules and Crystals, 25 may-01 jun, 2003, Sevastopol, Ukraine P.264.

   35. Evstigneev V.P., Baranovsky S.F., Davies D.B., Evstigneev M.P. Theoretical analysis of two-component equilibrium of aromatic molecules in solution based on NMR data // Book of abstracts of XVII International School-Seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals”, 20-26 Sept. 2005, Beregove, Ukraine, P.35.

   36. Розвадовская А.О., Евстигнеев М.П., Ширяева О.С., Веселков А.Н. ¹H ЯМР анализ самоассоциации антиопухолевого антибиотика дауномицина в различных буферных растворах // I Українська наукова конференція “Проблеми Біологічної і Медичної Фізики” ПМБФ-2004, 20-22 вересня 2004р., Харків, С.81.

   37. Khomich V.V., Evstigneev M.P. Self-association of antibiotic Doxorubicin and its hetero-association with Caffeine in aqueous solution // Book of abstracts of 3^rd International Conference ‘Physics of Liquid Matter: Modern Problems’, 27-31 May 2005, Kyiv, Ukraine. P.37.

   38. Rybakova K.A., Evstigneev M.P. ¹H NMR investigation of the self-association of antibiotic Norfloxacin and its hetero-association with Caffeine in aqueous solution // Book of abstracts of 3^rd International Conference ‘Physics of Liquid Matter: Modern Problems’, 27-31 May 2005, Kyiv, Ukraine. P.36.

   39. Evstigneev M.P., Veselkov A.N. NMR analysis of a dynamic equilibrium of molecular complexes of a bis-intercalator, ethidium homodimer, in aqueous solution // III з’їзд українського біофізичного товариства, 8-11 жов. 2002, Львів, Україна. С.50.

   40. Rogova O.V., Hernandez Santiago A., Evstigneev M.P., Veselkov A.N. Thermodynamical analysis of self-association of ethidium homodimer and its complexation with phenanthridine dye in aqueous solution // Book of Abstracts of XVI International School-Seminar Spectroscopy of Molecules and Crystals, 25 may-01 jun, 2003, Sevastopol, Ukraine P.233.

   41. Evstigneev M.P., Hernandez Santiago A.A., Evstigneev V.P. Equilibrium interaction of acridine homodimer with itself and ethidium bromide in aque-ous solution // III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions, 15-21 May, 2006, Kyiv, Ukraine, P.106.

   42. Veselkov A.N., Vysotsky S.A., Sigaev V.A., Evstigneev M.P., Zavyalova O.S., Veselkov D.A., Davies D.B. Molecular mechanism of caffeine action on complexation of biologically active aromatic molecules with DNA // 6-th International Conference on Applications of Magnetic Resonance in Food Science, 4-6 sept. 2002, Paris, France, P.229.

   43. Evstigneev M.P., Khomich V.V., Davies D.B. ¹H NMR study of the hetero-association of caffeine with anthracycline antibiotics // Book of abstracts of XVII International School-Seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals”, 20-26 Sept. 2005, Beregove, Ukraine, P.266.

   44. Evstigneev M.P., Rozvadovska A.O., Hernandez Santiago A., Veselkov A.N., Davies D.B. Analysis of the hetero-association of aromatic drug molecules in aqueous solution by ¹H NMR spectroscopy and molecular mechanics calculations // The first EENC/AMPERE joint meeting, 6-11 Sept. 2004, Lille, France, ID329.

   45. 
       Евстигнеев М.П., Розвадовская А.О., Эрнандес Сантьяго А., Веселков А.Н. Гетероассоциация ароматических молекул антиопухолевых антибиотиков и витаминов: анализ методами ¹H ЯМР спектроскопии и молекулярной механики // I Українська наукова конференція “Проблеми Біологічної і Медичної Фізики” ПМБФ-2004, 20-22 вересня 2004р., Харків, С.82.

   46. Davies D.B., Mykhina Yu.V., Djimant L.N., Evstigneev M.P. Non-covalent interactions of flavine-mononucleotide with aromatic drug molecules studied by NMR // Book of abstracts of XVII International School-Seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals”, 20-26 Sept. 2005, Beregove, Ukraine, P.267-268.

   47. Davies D.B., Mukhina Yu.V., Evstigneev M.P. ¹H NMR study of the hetero-association of mutagenic dyes, ethidium bromide and proflavine, with flavine-mononucleotide // Материалы III международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов, 21-25 марта 2005, Ростов-на-Дону, Россия, С.161.

   48. Hernandez Santiago A.A., Rozvadovska A.O., Evstigneev M.P. Hetero-association of antibiotic Nogalamycin with aromatic antitumour antibiotics // Book of abstracts of 3^rd International Conference ‘Physics of Liquid Matter: Modern Problems’, 27-31 May 2005, Kyiv, Ukraine. P.35.

   49. Evstigneev M.P., Rozvadovska A.O., Davies D.B. ¹H NMR of hetero-complexes of aromatic drug molecules: possible stabilisation by intermolecular hydrogen-bonds // Book of abstracts of the Joint Conference of British NMR-DG, AMPERE and EENC “Euromar”, 16-21 July 2006, York, England. P.65.

   50. Evstigneev M.P., Khomich V.V. Competitive binding of anthracycline antibiotics with a model DNA in the presence of caffeine // III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions, 15-21 May, 2006, Kyiv, Ukraine, P.110.

   51. Evstigneev M.P., Rybakova K.A., Rozvadovska A.O. Binding of antibacterial antibiotic norfloxacin with DNA oligomer in presence of caffeine studied by NMR // Book of abstracts of XVII International School-Seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals”, 20-26 Sept. 2005, Beregove, Ukraine, P.270.

   52. Evstigneev M.P. Influence of flavine-mononucleotide on DNA binding properties of aromatic drug molecules // III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions, 15-21 May, 2006, Kyiv, Ukraine, P.101.

   53. Евстигнеев М.П., Эрнандес Сантьяго А.А., Мосунов А.А., Симонова С.Н., Розвадовская А.О. Влияние гетероассоциации на параметры связывания антиопухолевых антибиотиков с олигомером ДНК // V Харьковская конференция молодых ученых «Радиофизика и СВЧ электроника» (секц.биофизики), 14-16 дек. 2005, Харьков, С.57.