Анотація до роботи:

Рибакова Х.О. Механізми взаємодії антибактеріального препарату норфлоксацину і ДНК-зв’язуючихся ароматичних лігандів у водному середовищі. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 – біофізика. – Севастопольський національний технічний університет, м. Севастополь, 2008.

Методами ¹Н ЯМР-спектроскопії і молекулярного моделювання проведено дослідження взаємодії хінолонового антибіотика норфлоксацину (NOR) з різними ароматичними біологічно активними сполуками (БАС) і ДНК у водному розчині. Отримано структурні і термодинамічні параметри самоасоціації NOR і гетероасоціациі NOR-БАС, розраховано компоненти вільної енергії реакцій взаємодії. Досліджено комплексоутворення NOR з олігомерами ДНК 5’-d(TpGpCpA) і 5’-d(СpGpCpG), встановлено термодинамічні параметри взаємодії і характер зв’язування антибіотика з одноланцюговою і дуплексною формами ДНК.

Досліджено процес сумісного зв’язування БАС з ДНК в трьохкомпонентних системах NOR-БАС-ДНК, розраховано співвідношення ефективностей інтерцепторного і протекторного механізмів дії, дано оцінку відносної зміни біологічного ефекту, а також встановлено граничні концентрації ароматичних БАС, при яких може спостерігатися ефект зміни біологічній активності у разі їх комбінації в дозі з NOR.

У даній роботі вперше розглянуто питання про можливу взаємодію антибактеріального препарату норфлоксацину з різними біологічно активними сполуками у фізіологічному розчині і ролі цієї взаємодії при сумісному зв’язуванні комбінацій NOR-БАС з ДНК. Отримані результати формують уявлення про механізми біологічної дії NOR на молекулярному рівні при сумісному використанні з різними ароматичними БАС і можуть мати застосування в області молекулярної біофізики, молекулярної біології і фармакології.

Основні результати роботи можуть бути сформульовані таким чином:

1. На підставі даних ЯМР-спектроскопії показано, що антибіотик NOR проявляє виражену тенденцію до агрегації типу стопки у водному розчині з високим значенням константи самоасоціації (K_NOR = 130 л/моль). Вперше визначено термодинамічні параметри самоасоціації і розраховано найбільш вірогідну структуру димерного комплексу молекул NOR.

2. З використанням концентраційних і температурних залежностей протонних хімічних зсувів проведено дослідження взаємодії антибіотику норфлоксацину з ароматичними БАС: антибіотиками (дауноміцином, ногаламіцином, новатроном, актиноміцином D), вітамінами (флавінмононуклеотідом, нікотинамідом) і кофеїном у водно-сольовому розчині. Показано, що взаємодія NOR-БАС, в цілому, носить характер нековалентного зв’язування типу стопки, що стабілізується стекінг-взаємодією ароматичних хромофорів. Визначено рівноважні константи і термодинамічні параметри гетероасоціації (ентальпія, ентропія) і розраховано найбільш вірогідні структури 1:1 гетерокомплексів NOR з молекулами БАС.

3. З використанням методів молекулярної динаміки, а також методу вирішення нелінійного рівняння Пуасона-Больцмана проведено аналіз компонент вільної енергії Гіббса реакцій гетероасоціації NOR з ароматичними БАС. Показано, що комплекси NOR-БАС стабілізовані переважно гідрофобними і ван-дер-ваальсовими взаємодіями, причому гідрофобний внесок виявляється домінуючим. Електростатичні взаємодії в гетерокомплексах є в цілому енергетично невигідними.

4. На підставі даних ЯМР-спектроскопії досліджено комплексоутворення NOR з фрагментами ДНК - 5’-d(TpGpCpA) і 5’-d(CpGpCpG) у водному розчині. Вперше отримано рівноважні параметри комплексоутворення з однонитковою і дуплексною формами олігомера ДНК: рівноважні константи, ентальпія і ентропія.

5. На підставі аналізу параметрів комплексоутворення NOR з ДНК, а також індукованих хімічних зсувів протонів антибіотику у складі різних комплексів, встановлено, що NOR зв'язується з дуплексами тетрамерів переважно за типом інтеркаляції. Комплексоутворення з однонитковою формою може відбуватися як за типом інтеркаляції, так і зовнішнім зв’язуванням. Сайтом переважної посадки антибіотика в дуплекс ДНК є GC-сайт.

6. На підставі результатів дослідження гетероасоціації NOR-БАС і NOR-ДНК зроблено висновок про можливу роль інтерцепторного (гетероасоціація) і протекторного (зв'язування з ДНК) механізмів зміни біологічного ефекту при сумісному використанні NOR з ароматичними БАС. Проведено дослідження процесу конкурентного зв’язування NOR з ДНК у присутності кофеїну, антипухлинних антибіотиків (DAU, NOG, NOV і AMD), і ароматичних вітамінів (FMN і NMD). Для всіх розглянутих комбінацій розраховано співвідношення ефективностей протекторного і інтерцепторного механізмів дії, а також дано оцінку відносної зміни біологічного ефекту.

7. Встановлено граничні концентрації ароматичних БАС, при яких може спостерігатися ефект зміни біологічної активності при їх сумісному використанні з норфлоксацином.

Публікації автора:

1. Анализ комплексообразования ароматических молекул антибиотика и витамина в водном растворе методом ¹H ЯМР спектроскопии: гетероассоциация актиномицина D и флавин-мононуклеотида / А. Н. Веселков, М. П. Евстигнеев, К. А. Рыбакова [и др.] // Биофизика. – 2005. – Т. 50. – С. 20–27.

2. Рыбакова К. А. Исследование самоассоциации хинолонового антибиотика норфлоксацина в водном растворе методом ¹Н-ЯМР спектроскопии / К. А. Рыбакова, А. А. Мосунов, М. П. Евстигнеев // Вестник СевГТУ (серия «Физика и Математика»). – 2005. – Вып. 70. – С. 87–95.

3. ¹Н-ЯМР исследование комплексообразования хинолонового антибиотика норфлоксацина с ДНК / М. П. Евстигнеев, С. Ф. Барановский, К. А. Рыбакова [и др.] // Молекулярная биология. – 2006. – Т. 40. – С. 894–899.

4. Evstigneev M. P. Complexation of norfloxacin with DNA in the presence of caffeine / M. P. Evstigneev, K. A. Rybakova, D. B. Davies // Biophys. Chem. – 2006. – Vol. 121. – P. 84–95.

5. Евстигнеев М. П. Гетероассоциация антибиотика норфлоксацина с ароматическими витаминами в водном растворе / М. П. Евстигнеев, К. А. Рыбакова, Д. Б. Дэвис // Биофизика. – 2006. – Т. 51. – С. 661–668.

6. Евстигнеев М. П. Комплексообразование антимикробного препарата норфлоксацина с антиопухолевыми антибиотиками антрациклиновой серии / М. П. Евстигнеев, К. А. Рыбакова, Д. Б. Дэвис // Физ. химия. – 2007. – Т. 81. – С. 923–929.

7. Рыбакова К. А. Комплексообразование противомикробного препарата норфлоксацина и антиопухолевого антибиотика актиномицина D в водном растворе / К. А. Рыбакова // Вестник СевГТУ (серия «Физика и Математика»). – 2007. – Вып. 85. – С. 11–16.

8. Рыбакова К. А. Исследование связывания антибиотика норфлоксацина с

ДНК в присутствии ароматических биологически активных соединений / К. А. Рыбакова, М. П. Евстигнеев // Биофизический вестник ХНУ им. В.Н. Каразина. – 2007. – Вып. 19. – С. 36–42.

9. Rybakova K. A. ¹H NMR investigation of the self-association of antibiotic norfloxacin and its hetero-association with caffeine in aqueous solution / K. A. Rybakova, M. P. Evstigneev // III International Conference “Physics of Liquid Matter: Modern Problems”.–May 27-30, 2005. : Book of abstracts. – K., 2005. – P. 36.

10. Evstigneev M. P. Hetero-association of antibacterial agent Norfloxacin with aromatic antitumour antibiotics / M. P. Evstigneev, K. A. Rybakova // III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions–Kyiv, Ukraine, May 15-21, 2005. : тезисы докл. К., – 2005. – P. 11–16.

11. Рыбакова К. А. Исследование связывания антибиотика норфлоксацина с фрагментом ДНК 5’-d(TpGpCpA) методом ЯМР спектроскопии / К. А. Рыбакова, С. Ф. Барановский, М. П. Евстигнеев // Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии “БФФХ - 2005” : IV всеукр. научн.-техн. конф., 4-9 апр. 2005 г. : тезисы докл. – С., 2005. – С. 121–122.

12. Рыбакова К.А. ¹Н-ЯМР анализ взаимодействия антибиотика норфлоксацина с ароматическими витаминами в водном растворе // Материалы всеукр. науч.-техн. конф. «Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики. Физика. Биофизика–2005»–Севастополь: Изд-во СевНТУ, 2005.–С. 122–123.

13. Evstigneev M. P. Binding of antibacterial antibiotic norfloxacin with DNA oligomer in presence of caffeine studied by NMR / M. P. Evstigneev, K. A. Rybakova, A. O. Rozvadovska // Proc. XVII International School-Seminar “Spectroscopy of Molecules and Crystals”. - Beregove (Ukraine), 20-26 сент. 2005 г.: тезисы докл. – C., 2005. – P. 270.

14. Рыбакова К. А. Комплексообразование антибиотика норфлоксацина с ароматическими биологически активными соединениями / К. А. Рыбакова, М. П. Евстигнеев // IV съезд Украинского биофизического общества (УБФО-2006), 19 – 21 дек. 2006 г. : тезисы докл. – Донецк, 2006. – С. 134–135.

15. Рыбакова К. А. Энергетический анализ комплексообразования антибиотика норфлоксацина и биологически активных соединений / К. А. Рыбакова // Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии “БФФХ - 2008” : IV всеукр. научн.-техн. конф., 21-26 апр. 2008 г. : тезисы докл. – С., 2008. – С. 174–176.

16. Рыбакова К. А. Механизмы взаимодействия антибактериального препарата норфлоксацина и ДНК-связывающихся ароматических лигандов в водной среде / К. А. Рыбакова, М. П. Евстигнеев // Актуальные вопросы теоретической и прикладной биофизики, физики и химии “БФФХ - 2008” : IV всеукр. научн.-техн. конф., 21-26 апр. 2008 г. : тезисы докл. – С., 2008. – С. 170-173.